一、背景介紹

黃酒是中國(guó)的民族特產(chǎn)，也稱為米酒（ricewine），在世界三大釀造酒（黃酒、葡萄酒和啤酒）中占有重要的一席。釀酒技術(shù)獨(dú)樹(shù)一幟，成為東方釀造界的典型代表和楷模。近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)黃酒在發(fā)酵過(guò)程中不可避免會(huì)產(chǎn)生圓弧偶氮酸，這就要求必須對(duì)圓弧偶氮酸進(jìn)行檢驗(yàn)。

圓弧偶氮酸（Cyclopiazonic acid ,CPA）是曲霉屬和青霉屬的圓弧青霉的代謝產(chǎn)物，別名環(huán)匹阿尼酸。CPA是一種神經(jīng)毒，可造成肝臟、腎臟和胃腸道損傷，體重下降、虛弱，出現(xiàn)食欲不振、腹瀉、脫水、精神沉郁、角弓反張、抽搐等癥狀，能影響鈣的吸收，降低蛋殼質(zhì)量，影響種禽孵化，可在肉蛋奶中有殘留。據(jù)報(bào)道，有人從食品和飼料中分離出大量青霉菌，從中鑒定出數(shù)十種真菌毒素，而其中多的就是CPA。它廣泛存在花生、大豆等糧食作物中，往往與黃曲霉毒素同時(shí)存在，因此CPA的中毒往往被黃曲霉毒素中毒所掩蓋。

目前環(huán)匹阿尼酸的檢測(cè)方法包括：薄層色譜法（TLC）、液相色譜法（HPLC）等。其中，Zambonin、李業(yè)鵬等人用50μm CW/TPR作為萃取纖維,以HPLC-UV/DAD為分離檢測(cè)手段,分別分析測(cè)定了奶酪中的圓弧偶氮酸,該方法的檢測(cè)限為7ng/mL。但是相關(guān)的檢測(cè)圓弧偶氮酸的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)尚未制定，也沒(méi)有針對(duì)黃酒的圓弧偶氮酸檢測(cè)的解決方案，為此普瑞邦推出了專門(mén)用于凈化濃縮圓弧偶氮酸的多功能凈化柱。該快速凈化柱，是利用多機(jī)能吸附填料吸附取出霉菌毒素檢測(cè)中的干擾峰的一類固相親和柱，適用于HPLC液相檢測(cè)谷物類、豆類、花生堅(jiān)果類和黃酒中的圓弧偶氮酸的樣品凈化，凈化步驟簡(jiǎn)單快捷，回收率高。

二、多功能凈化柱-液相色譜法

1. 所需設(shè)備和耗材　　

液相色譜儀及色譜柱：真菌毒素色譜柱（PRC-18，Pribolab）。

多功能凈化柱：PriboFast^® 230 環(huán)匹阿尼酸多功能凈化柱(M2300，5ml，25支/盒，Pribolab)。

高速均質(zhì)器：達(dá)到22000rpm 以上(EQ-WR-1L，Pribolab)。

玻璃纖維濾紙：PriboFast^®玻璃纖維濾紙（GMF-110，Pribolab）

標(biāo)準(zhǔn)品：圓弧偶氮酸/環(huán)匹阿尼酸（STD#8022，Pribolab）

2．樣品前處理

2.1、量取25毫升黃酒，置入250毫升均質(zhì)器或250毫升錐形瓶中。依次加入70毫升甲醇和10毫升6%的碳酸氫鈉水。高速攪拌2分鐘（均質(zhì)器）或在搖床上搖動(dòng)1小時(shí)。

2.2、將萃取液通過(guò)Whatman 4號(hào)濾紙或者玻璃纖維濾紙，然后，吸取50毫升的濾液到250毫升的分液漏斗中。加入100毫升己烷（脫脂提取物）輕輕混合避免乳化。

2.3、在兩層分離后，小心將另一個(gè)分液漏斗收集水液層下的液體，添加50毫升的10% KCL水溶液。棄掉正己烷。以2毫升6N鹽酸酸化后，加入CHCL₃ 50毫升，輕輕地混合，用250毫升的錐形瓶收集下面的有機(jī)層。

2.4、加入的50毫升CHCL₃采用重復(fù)方法提取，合并兩次的CHCL₃提取物于錐形瓶?jī)?nèi)。添加50克無(wú)水硫酸鈉鹽（硫酸鈉），靜置1小時(shí)。

2.5、過(guò)濾萃取液并全部收集到200毫升的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中,40ºC下蒸干。

3. 多功能凈化柱凈化

3.1、凈化柱活化：將PriboFast 230 環(huán)匹阿尼酸多功能凈化柱以15毫升CHCL₃過(guò)柱，控制大流速在3毫升/分鐘，不要讓柱干涸。

3.2、富集：用10毫升CHCL₃溶解旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器瓶中干燥后的提取物，在大流速2毫升/分鐘條件下過(guò)柱。

3.3、洗滌：不要讓柱干涸。至全部溶液過(guò)柱后，開(kāi)始洗滌柱子。以10毫升CHCL₃：丙酮（1 + 1）和10毫升CHCL₃：甲醇（95 + 5）從頂端洗柱后，以10毫升C₄H₁₀O繼續(xù)洗滌。丟棄洗滌溶液。

3.4、洗脫CPA：用10毫升CHCL₃:甲醇（75:25）過(guò)柱洗脫，控制大流量為2毫升/分鐘，使用合適的容器收集洗脫液（例如，20毫升的錐形試管，優(yōu)選烷化硅）。

3.5、吹干：氮?dú)饣蛟谡婵?0℃水浴中干燥蒸發(fā)洗脫液。

3.6、復(fù)溶：用1毫升的流動(dòng)相溶解殘?jiān)?。采用渦流混合30秒和超聲波溶解標(biāo)本。

4. 配制標(biāo)準(zhǔn)溶液和標(biāo)準(zhǔn)添加溶液

4.1、CPA貯存溶液：100μg/ml溶于甲醇。

4.2、工作標(biāo)準(zhǔn)：吸取100μL濃度為100μg/mlCPA標(biāo)準(zhǔn)溶液（10μgCPA）至琥珀色自動(dòng)采樣瓶中，溶解于0.9毫升的流動(dòng)相中。相對(duì)應(yīng)的濃度是10μg/ml。

5. HPLC條件